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Safe Harbor 基因敲入試劑盒及敲入克隆
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通過在染色體上的特定位點(diǎn)插入目的基因和其他遺傳因子，對基因組進(jìn)行改造——這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞工程上具有極大的價(jià)值。經(jīng)過基因改造的細(xì)胞在醫(yī)學(xué)研究、基因功能研究及族系跟蹤和分析中扮演著重要的角色。而所有這些應(yīng)用都取決于轉(zhuǎn)入基因功能的可靠性和可預(yù)測性，同時(shí)需要轉(zhuǎn)入基因不擾亂內(nèi)源基因和/或其他調(diào)控因子的功能。相反，隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)入基因會帶來不可預(yù)知的插入或突變，構(gòu)成威脅。
今年發(fā)展的新實(shí)驗(yàn)方法是將基因轉(zhuǎn)入基因組上一個(gè)已知的安全位點(diǎn)。人類第19號染色體上的 AAVS1（又名為 PPP1R2C 位點(diǎn)）或者小鼠基因組上的 ROSA26 就是這種經(jīng)過驗(yàn)證的“安全港”位點(diǎn)。它們具有開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，能保證轉(zhuǎn)入基因片段的功能。最重要的是，在這些位點(diǎn)插入外源基因片段對細(xì)胞無已知的副作用。
特異靶向 safe harbor 位點(diǎn)的 TALEN 或 CRISPR-Cas9 能在基因組的 safe harbor 位點(diǎn)上生成 DNA 雙鏈斷裂（DSB），誘發(fā) DNA 的自然修復(fù)機(jī)制，促使該位點(diǎn)與對應(yīng)的 ORF 敲入克隆之間發(fā)生同源重組（HR）（圖1），將 ORF 敲入克隆上的 DNA 片段整合到基因組的 safe harbor 位點(diǎn)。
圖1. 基因組編輯工具介導(dǎo)的 safe harbor 基因敲入原理圖
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